硝酸鹽是污水處理廠尾水中氮的主要形式, 15 mg·L-1的總氮含量能夠滿足城鎮污水處理廠污染物排放的一級A標準, 但仍遠超2 mg·L-1的地表水環境V類水標準.硝酸鹽的積累導致水體富營養化, 對環境造成極大的危害.另外, 飲用水中硝酸鹽含量過高還可能會引發癌癥, 危害人體健康.因此, 對低濃度硝酸鹽水體的深度處理也日益受到重視.
生物脫氮是一種**、經濟、環保的脫氮方法, 在水體修復過程中經常利用反硝化細菌進行硝酸鹽的脫除.但是反硝化細菌活性受環境影響較大, 如碳源、硝酸鹽濃度、pH和溫度等.有研究表明, 低溫能夠抑制酶的活性, 減緩微生物的生長, 導致反硝化作用明顯減弱.反硝化細菌生長的*佳溫度為25~35℃, 而我國冬季氣溫通常低于20℃, 低溫成為冬季微生物反硝化脫氮的限制性因素.目前關于反硝化細菌的研究主要集中于對硝酸鹽去除能力的提高, 對低溫限制下低濃度硝酸鹽水體中反硝化作用的研究仍然較少. Huang等報道Acinetobacter sp. Y16在實驗室低溫條件下能夠取得良好的去除效果, 但沒有進一步考察其在水體修復長期應用過程中的穩定性.
本研究分離得到1株低溫反硝化菌——施氏假單胞菌, 命名為N3.在此基礎上, 考察了初始硝酸鹽濃度、溫度, 特別是低溫對N3反硝化性能的影響.由于水體中C/N普遍較低, 碳源缺少對微生物脫氮產生抑制, 因此本研究分析了不同C/N對硝酸鹽去除性能的影響.
1 材料與方法1.1 培養基
溴百里酚藍培養基(BTB, g·L-1):L-天冬氨酸10; KNO3 10; KH2PO4 10; FeCl2·6H2O 0.5; CaCl2 1.5; MgSO4·7H2O 10. BTB(1%乙醇溶液)10 mL; pH 7.0~7.3.
反硝化培養基(g·L-1):檸檬酸鈉5; KH2PO4 1; K2HPO4 1; KNO32; MgSO4·7H2O 0.2. pH 7.2~7.5.
亞硝酸鹽培養基(g·L-1):檸檬酸鈉5; KH2PO4 1; K2HPO4 1; NaNO22(過濾除菌); MgSO4·7H2O 0.2. pH 7.2~7.5.
1.2 菌株的分離和鑒定
將10 mL泥水混合物轉移到100 mL反硝化培養基中, 15℃下連續富集培養.將富集培養后的菌液系列稀釋, 分別取10-4、10-5、10-6、10-7濃度下菌液200 μL, 均勻涂布到BTB平板上, 反復分離純化后挑取藍色單菌落, 進行后續研究.
基于菌株的16S rDNA序列進行菌種鑒定.菌體總DNA參照EasyPure Genomic DNA Kit(北京全式金生物工程有限公司)的方法進行提取.采用細菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行擴增, PCR反應體系(50 μL): 10×Buffer 5.0 μL, dNTPs 4.0 μL, 上游引物和下游引物各1.0 μL, 重蒸水38 μL, 離心混勻后加入DNA模板0.5 μL, Taq酶0.5 μL. PCR反應條件:① 94℃預變性5 min; ② 94℃變性50 s; ③ 52℃退火60 s; ④ 72℃延伸90 s; ⑤ 72℃, 10 min; ②~④步驟循環30次. PCR產物純化后交由上海生工生物有限公司進行測序.
將獲得的細菌16S rDNA序列(MF521886)提交到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), 利用Blast進行比對, 并結合已有研究中得到驗證的相關反硝化細菌序列, 進行同源性比較.利用MEGA7.0軟件進行多序列比對分析, 并用Neighbor-Joining法構建系統發育樹.
1.3 理化指標分析方法
亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮的濃度分別按照N-(1-萘基)-乙二胺光度法、紫外分光光度法、過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法測定, 儀器采用UV 5200紫外/可見分光光度計.去除率按照以下公式計算:
式中, ci代表初始氮濃度(mg·L-1), ct代表終態氮濃度(mg·L-1).
1.4 NarG、nirS和nosZ基因的擴增
反硝化功能基因narG、nirS和nosZ的擴增引物和條件見表 1, 得到的PCR產物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.
表 1 PCR擴增過程中的引物和程序設計
1.5 環境條件對反硝化功能的影響
分別調節C/N為4、8和12, 溫度為4、10、20、30、40、50和60℃, 初始硝酸鹽濃度為15、30、40、50、60、70、80、90和100 mg·L-1, 研究不同C/N、溫度、硝酸鹽濃度對反硝化過程的影響.每個實驗均設3個平行, 同時設空白實驗作對照.除上述單因素影響實驗外, 硝酸鹽初始濃度為15 mg·L-1, 反應溫度為30℃, C/N=8.
1.6 低溫對反硝化功能及基因表達的影響
分別于4、10和15℃下, 定時檢測硝酸鹽的去除情況.在4、10和30℃條件下, 分別在反應36 h時取一定量的菌液, 6 000 r·min-1離心5 min, 棄上清, 用適量無菌生理鹽水重懸, 調節D600為1.各自吸取2 mL菌液, 用Trizol法(北京全式金生物有限公司)提取基因組RNA, 用PrimeScriptTMRT reagent Kit(大連寶生物工程有限公司)進行反轉錄, 隨后利用SYBR Premix Ex TaqⅡ(大連寶生物工程有限公司)進行定量PCR, 對narG、nirS基因的表達活性進行檢測.實驗中用到的引物和反應條件詳見表 1.
1.7 低溫下固定化反硝化菌的運行穩定性實驗
用10 mL菌體含量為0.2 g的濕菌體與10%的PVA和1%的SA溶液混合均勻, 緩慢滴入1% CaCl2飽和硼酸溶液中, 4℃交聯24 h進行固定化, 制備得到直徑為0.5 cm左右的均勻小球.將固定化后的N3投加到垂直流裝置中, 采用人工配制的低污染水(水質指標見表 2), 以2~3 d為一個進水周期, 在10℃下進行半連續實驗.初始C/N=8, 穩定運行4個周期后, C/N調為4.每12 h定時取樣, 檢測硝酸鹽的去除.
表 2 人工配制的低污染水基本水質指標
2 結果與討論2.1 菌株的分離和鑒定
在15℃時, 采用反硝化培養基經連續富集培養、BTB平板篩選, 得到1株反硝化細菌.它能夠在36 h內將硝酸鹽完全去除, 且沒有亞硝酸鹽的積累, 命名為N3.
菌株N3在富集培養基平板上培養24 h, 菌落呈圓形, 淡黃色, 半透明狀, 邊緣光滑.細胞為短桿狀, 大小為(1.5~2.0 μm)×(0.8~1.5 μm), 革蘭氏染色呈陰性.系統發育樹如圖 1所示, 菌株N3與施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)在同一分支, 同源性達99%, 可初步鑒定為施氏假單胞菌.
圖 1
為進一步驗證N3的反硝化能力, 對N3進行了反硝化功能基因的檢測.由圖 2可見, 反硝化功能基因narG、nirS和nosZ均成功地從N3基因組中得到擴增.
圖 2
圖 3
圖 4
圖 5
圖 6
圖 7
圖 8
圖 9
3 結論
(1) 從富營養化水體中分離得到1株低溫反硝化細菌N3, 革蘭氏陰性菌.菌株鑒定結果表明, N3為施氏假單胞菌.
(2) 菌株N3在C/N=8, 硝酸鹽濃度低于70 mg·L-1時, 能實現硝酸鹽的完全去除. N3具有良好的低溫適應性, 4℃時可在36 h內實現對15 mg·L-1硝酸鹽的完全去除; 反硝化基因narG、nirS的表達與30℃處于同一個數量級.在10℃下的低溫半連續實驗中, 固定化N3在運行的54 d中無菌體外泄情況且去除效果穩定, 可作為低溫低C/N下的反硝化候選菌株, 對于冬季水體中硝酸鹽的去除具有良好的應用潛力.
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